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大鼠白介素1β(IL-1 β)酶联免疫试剂盒

北京索莱宝提供高品质的大鼠白介素1β(IL-1 β)酶联免疫试剂盒 Rat IL-1β ELISA KIT,也可以帮客户开发定制ELISA KIT。我们注重高端技术的掌握和优化、自有产品的研发和生产,同时强调良好的售后服务和技术支持,我们为广大科研学者而服务,一直在路上。

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大鼠白介素1β(IL-1 β)酶联免疫试剂盒

背景介绍:

IL-1分子IL-1有两种不同的分子形式,一种称IL-1α,由159个氨基酸组成;另一种称为IL-1β,含153个氨基酸,两者由不同的基因分别编码。虽其氨基酸顺序仅有26%的同源性,然而IL-1α和IL-1β以同样的亲和力结合于相同的细胞表面受体,发挥相同的生物学作用。T细胞、成纤维细胞表面IL-1R为80kDa,而B细胞则为68kDa, 分别称为IL-1RI(CDw121a)和IL-1RⅡ(CDw121b)。IL-1受体复合物至少由IL-1或IL-1β,Ⅰ型IL-1R(IL-1RⅠ),IL-1R辅助蛋白(IL-1RAcP)三部分组成,这一复合物介导了IL-1的信号转导,IL-1α和IL-1β是IL-1R激动性配基。

大鼠IL-1β的cDNA编码一个由268个氨基酸残基组成的前体蛋白,116个氨基酸残基在胞内由半胱氨酸蛋白酶IL-1β-转换酶,(Caspase-1/ICE)切割,产生具有活性的细胞因子。

 

检测原理

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。首先,将抗大鼠IL-1β单克隆抗体包被在酶标板上;然后,分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本,标准品和样本中的大鼠IL-1β会与酶标板上的包被抗体结合;洗去未结合物质,加入生物素化抗大鼠IL-1β抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素,生物素与链霉亲和素会发生特异性结合;洗去未结合物质,加入显色剂底物TMB;若反应孔中样品存在不同浓度的大鼠IL-1β,则HRP会使无色TMB变成不同深浅的蓝色物质,加入终止液后反应孔会变成黄色;zui后,在λmax=450nm处测定反应孔样品吸光度,样本中的大鼠IL-1β浓度与颜色反应的深浅成正比,通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中大鼠IL-1β的浓度。

 

原理图:(图1) 

注意事项:

  • 试剂盒应在有效期内使用,请不要使用过期的试剂。
  • 试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱,已复溶未用完的标准品,请丢弃。
  • 试剂盒使用前在室温恢复30min,且充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
  • 在试验中标准品和样本建议作复孔检测,且加入试剂的顺序应保持一致。
  • 为避免交叉污染,请在试验中使用1次性的试管,枪头及洁净的塑料容器。.
  • 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少,在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶盖上,使用前请离心处理(5-10 S即可),使管壁上的液体集中在管底部,取用时,请用移液器小心吹打几次。
  • 除了试剂盒中的浓缩洗涤液、终止液可以通用外,请不要使用其他来源的试剂盒代替本试剂盒中的某单个组分。
  • 为保证结果准确,每次检测均要做标准曲线。

 

安全提示:试剂盒中的终止液为酸性溶液,请使用时带上手套并注意防护;避免试剂接触皮肤和眼睛,如果不慎接触,请用大量清水清洗;检测血液样本及其它体液样本时,请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。

 

试剂盒组成及储存

试剂盒组成

规格(96T)

规格(48T)

保存条件

抗体预包被酶标板

 

8*12

8*6

4℃

标准品

2支

1支

4℃

标准品/样本稀释液(SR1)

16ml/瓶

1瓶16ml

4℃

浓缩生物素化抗体

400ul(30X)

200ul(30X)

4℃

抗体稀释液(SR2)

16ml/瓶

1瓶 16ml

4℃

浓缩酶结合物(避光)

400ul(30X)

200ul(30X)

4℃

酶结合物稀释液(SR3)

16ml/瓶

1瓶16ml

4℃

浓缩洗涤液 (20×)

30ml/瓶

1瓶 30ml

4℃

显色底物(避光)

12ml/瓶

1瓶 6ml

4℃

终止液

12ml/瓶

1瓶12ml

4℃

封板胶纸

4张

2张

 

说明书

1份

1份

 

 

 

自备实验器材(不提供,可代购)

  • 酶标仪(主波长450nm,参考波长570nm或630nm)
  • 高精度移液器及一次性吸头:0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
  • 洗板机或洗瓶
  • 37℃孵箱
  • 双蒸水,去离子水,量筒等
  • 稀释用聚丙烯试管

 

样本收集及储存:

  • 细胞培养上清:

    将细胞培养基移至无菌离心管,在4℃条件下1000 g(1500 rpm)离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。。

  • 血清样本:

    室温血液自然凝固20 min后,在4℃条件下1000 g(1500 rpm)离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),保存过程中如有沉淀,请再次离心,避免反复冻融。

  • 血浆样本:

将全血收集到含抗血凝剂的管中,根据标本的实际要求选择EDTA,柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合20 min,在4℃条件下1000 g(1500 rpm)离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。

 

注意:血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本,以免影响检测结果;如果样本中的检测浓度高于标准品的zui高值,请将样品做适当倍数稀释后检测,建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。

 

试剂准备

  • 试剂回温:首先在实验前30min将试剂盒,待测样本放置于室温下,浓缩洗涤液如出现结晶,请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
  • 配置洗涤液:预先计算好稀释后的洗涤液使用体积,然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液,未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。

3. 标准品梯度稀释:加入标准品/样本稀释液(SR1)0.8ml至冻干标准品中,静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为4000pg/ml),然后按照以下浓度:4000、2000、1000、 500、 250、125、62.5、 0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液(4000pg/ml)未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装,并将其贮存在-20~-80℃冰箱,具体如下(图2)。

 

4. 生物素化抗体工作液:预先计算好试验所需用量,用检测稀释液(SR2)将30倍抗体浓缩液稀释成1倍应用液(稀释前充分混匀),请在30分钟内加入到反应孔中。

   具体稀释方法如下:

板条

浓缩生物素化抗体(1:30):μL 

检测稀释液(SR2):μL

2

67

1933

4

133

3867

6

200

5800

8

267

7733

10

333

9667

12

400

11600

 

5. 酶结合物工作液:按每次试验所需用量配制,稀释前充分混匀,用酶结合物稀释液(SR3)按1:30倍稀释,将浓缩酶结合物稀释成工作液,请在30分钟内使用

 

  具体稀释方法如下:

 板条

浓缩酶结合物(1:30):μL

检测稀释液(SR3):μL

2

67

1933

4

133

3867

6

200

5800

8

267

7733

10

333

9667

12

400

11600

 

洗涤方法:

  • 自动洗板:甩尽酶标板孔中液体,在厚迭吸水纸上拍干,注入洗涤液为300ul/孔,注入与吸出间隔为30秒,洗板5次。
  • 手工洗板:甩尽酶标板孔中液体,在厚迭吸水纸上拍干,用洗瓶加入洗涤液300ul/孔,静止30秒后甩净酶标板孔中液体,在厚迭的吸水纸上拍干,洗板5次。

检测步骤: 

结果判断

1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测,参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测,请用 450 nm 的OD测定值减去630 nm的OD测定值。

2.计算标准品、样品的平均OD值:每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值

3.以标准品浓度为横坐标,吸光度OD值为纵坐标,用软件绘制标准曲线,样品中IL-含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限,应做适当稀释后重新检测,计算浓度时再乘以稀释倍数。

 

参数表征

1. 数据及标准曲线

 

 

 

 

 

 

 

 

标准品浓度

OD1

OD2

平均值

矫正值

 

(pg/ml)

 

0

0.086

0.078

0.082

-----

 

62.5

0.124

0.116

0.120

0.038

 

125

0.196

0.203

0.199

0.117

 

250

0.342

0.324

0.333

0.251

 

500

0.462

0.495

0.478

0.396

 

1000

0.769

0.724

0.746

0.664

 

2000

1.698

1.715

1.706

1.624

 

4000

2.536

2.583

2.559

2.477

 

本图3仅供参考,应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算大鼠IL-1β的样本含量

2. 灵敏度:

zui低可检测大鼠IL-1β浓度达31pg/ml,

20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差,计算相应的可检测浓度。

 

3. 特异性:

不与IL-2、4、6、8、10、IFN-gamma 、TNF-alpha等反应

 

4. 重复性:

板内,板间变异系数<10%

 

5. 回收率:

健康大鼠血清、血浆中加入 3 个不同浓度水平的大鼠 IL-1β,计算回收率。

样本类型

平均回收率(%)

范围(%)

血清

95

86-103

血浆

93

91-116

 

6. 线性稀释

选取4 份健康大鼠血清加入高浓度的大鼠IL-1β,在标准曲线的动力学范围内进行系列稀释,评估检测的线性。

稀释

平均值(%)

范围(%)

1:2

96

90-105

1:4

96

86-110

1:8

98

89-105

1:16

97

92-108

 

 

参考文献

1. Dinarello, C.A. (1994) Eur. Cytokine Netw. 5:517.

2. Dinarello, C.A. (1996) Blood 87:2095.

3. March, C.J. et al. (1985) Nature 315:641.

4.  Thornberry, N.A. et al. (1992) Nature 356:768.

5. Sims, J.E. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8946.

6.  Sims, J.E. et al. (1988) Science 241:585.

7.  McMahan, C.J. et al. (1991) EMBO J. 10:2821.

8.  Huang, J. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12829.

9. Greenfeder, S.A. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:13575.

10.  Wesche, H. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:7727.

 

 

常见问题及解决方法

问题

可能原因

解决方法

 

 

高背景或阴性对照值偏高

洗板不充分

将洗涤液注入反应孔充分洗涤,彻底拍干孔中液体

酶结合物过量

检查酶稀释度,按说明书标识的稀释度稀释

底物污染

加底物前检查底物是否为透明无色,勿用变蓝的底物,重新用新的底物试验

阴性对照孔被阳性对照污染

注意洗涤时不要把洗液溢出孔外,不使阴阳对照孔液体涟接一起

不同批试剂混用

检查试剂批号,勿用不同批号试剂

 

 

 

显色信号弱

试剂过期

检查试剂盒有效期,不使用过期试剂

孵育时间过短

按说明书中规定的孵育时间孵育

试剂污染

检查试剂是否污染

酶标仪滤光片不匹配

检查酶标仪设置及滤光片

试剂盒平衡不充分

确保试剂盒试验前平衡至室温

显色时间不够

增加底物显色时间

 

 

无显色信号

检测抗体、酶、或显色剂漏加

检查试验操作流程,重复试验

酶被缓冲液污染

使用新配配制的试剂

试剂添加顺序有误

检查复核试验添加顺序、流程,重复试验

标曲佳但样品孔无信号

样品含量低或样品中无检测物

设置阳性对照,重复实验

样品基质遮盖检测

重新稀释样品再测

标曲佳但样品信号偏高

样品中待检物超过标准曲线范围

重新稀释样品再测

边缘效应

孵育温度不均衡

孵育时每步均使用封板胶纸,避免在环境温度变化大的地方孵育,勿叠放反应板

 

大鼠白介素1β(IL-1 β)酶联免疫试剂盒订购说明:

1、绝大部分产品备有现货,一般情况下都能订货当日发货。 
2、部分非常用产品,需提前1-2日预订,海外期货则需要提前3-6周预订。 
3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化,若有变动以订货当日zui新价格为准。 
4、每日订单截止时间为16点整,部分城市可到17点整,因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。
5、请办理完货款后,将底单等连同收货人的地址、姓名、电话等以传真、EMail、短信、电话等形式通知我们。


大鼠白介素1β(IL-1 β)酶联免疫试剂盒运输说明:

极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。用干冰把产品包裹起来,再用泡沫盒密封,胶带层层粘住泡沫盒,放入索莱宝专用的箱子,然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送至客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
低温产品:低温产品运输过程中加装索莱宝专用冰袋运输。事先用冰袋把产品包裹起来,再使用泡沫盒密封,用胶带严实密封泡沫盒,再放入索莱宝专用的箱子(保温效果zui少可以持续一周),然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送至客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
常温产品:常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。产品由公司库房人员快速配货,准确快速高效的快递保证产品快速送达您的手中。

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