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酵母质粒提取试剂盒厂家详解提取质粒的基本步骤
点击次数:31 发布时间:2018-10-29

   质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子,多存在于细菌及酵母菌等生物中,是基因工程中最常用的运载体,担负着将目的基因转移到宿主细胞中的重要使命。

   质粒DNA提取可以:
 
(1)快速纯化质粒;
(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

   酵母质粒提取试剂盒厂家下面详解提取质粒的基本步骤:

①细菌的培养和质粒的扩增

1.将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板(一种培养基,使质粒扩增)。
2.置于37℃恒温培养箱,培养12-17h,待长出菌落。
3.灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基,编号标记。
4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基,每个培养基放置1个菌落。
5. 37℃,180rpm,振荡培养过夜。

②细菌菌体的裂解

1.离心扩增好的菌液,按说明书将菌液重悬,转入1.5ml离心管中。
2.用质粒小量抽提试剂盒,按说明书要求提取质粒。
3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。
4.加入250ulRB溶液,振荡器充分悬浮细菌。
5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次,使细菌裂解,室温,放置2min。
6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次,使之充分中和,室温,放置2min。
7.室温,1500rpm,高速离心15min。
8、将吸附柱放入收集管内,离心得到的上清转移至吸附柱,室温,15000rpm,高速离心30s。
9、弃废液,将吸附柱放入收集管,加入700ul WB溶液到吸附柱中,15000rpm,高速离心30s。
10、重复上一操作。
11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中,加30-50ul预热的Elution Buffer,室温,放置2min,高速离心1min。
12、样品进行电泳检测:1%琼脂糖凝胶电泳,上样量为2ul,紫外灯下观察,最明亮的带为超螺旋形式,可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

③质粒DNA的纯化
1. 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中,加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。
2. 加入2倍体积的无水乙醇,放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。
3. 4℃,高速离心机14000rpm,离心20min.
4. 弃去上清,70%乙醇洗2次。
5. 空气干燥,可置超净工作台干燥。
6. 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀,即为质粒溶液。
7. 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

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