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Peroxidase(POD)辣根过氧化物酶厂家分享Western实验步骤

点击次数:118 发布时间:2018/7/19
提 供 商: 北京索莱宝科技有限公司 资料大小:
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详细介绍:

   Western是用抗体检测蛋白的重要方法之一,Western可以参考如下步骤进行操纵:

1、收集蛋白样品

   可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提。

    收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。由于不同的蛋白浓度测定方法对于一些往垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

2、电泳

(1)SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制。该试剂盒提供了除水和配胶用具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

(2)样品处理

在收集的蛋白样品中加进适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。

(3)上样与电泳

冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判定蛋白分子量大小,j建议使用预染蛋白质分子量标准。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进进下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处四周即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3、转膜

推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操纵过程中特别是用镊子夹取等过程中轻易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

通常假如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。

在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,推荐把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。

4、封闭

转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先预备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗往膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤,一定要留意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。

用微型台式真空泵吸尽洗涤液,加进Western封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体,可以在4℃封闭过夜。

5、一抗孵育

参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。

用微型台式真空泵吸尽封闭液,立即加进稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。假如一抗孵育一小时效果不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。

回收一抗。加进Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加进洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。假如结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6、二抗孵育

参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液稀释Peroxidase(POD)辣根过氧化物酶标记的二抗。

用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加进稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

回收二抗。加进Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加进洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。假如结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7、蛋白检测

参考相关说明书,使用BeyoECL,Western荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。

洗片时可以使用X光片自动洗片机。假如没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。

8、膜的重复利用

假如蛋白样品非常宝贵,可以使用Western一抗二抗往除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。

 

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